Immunoproteomic analysis of Cryptococcus neoformans antigens reactive with sera from patients with cryptococcosis in Colombia
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Visión General
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Abstracto
Introduction. Cryptococcus neoformans (Cn) is the main etiological agent of cryptococcosis, a life-threatening systemic mycosis and one of the leading secondary infections among HIV-positive patients. In Colombia, cryptococcosis has an annual incidence of 2.3 cases per million inhabitants, affecting predominantly patients with AIDS, and with a mortality of up to 47.5% of the cases. Despite the benefits of available antifungal drugs, their use is limited by the emergence of drug-resistant fungal strains and several side-effects resulting from long term medication. It is also known that while a T-helper (Th)1 response elicits protective immunity during cryptococcosis, a Th2 response assists fungal growth leading to peripheral dissemination. Therefore, adjunctive immunotherapy, addressed to skew a detrimental response towards a protective response, together with antifungal treatment, is a promising option for the future. Materials and methods. Serum samples from Cn-cryptococcosis patients (n=113) and control patients with other mycoses (n=3) from Colombia were included in this study. Using ELISA, total levels of Th2-dependent immunoglobulin (Ig)E and IgG4 and levels of Cn-specific IgG were determined in sera. Protein extracts from C. neoformans H99 were separated by 1D-SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane by Western blot. Membranes were subsequently incubated with sera to detect antigens reactive with IgG antibodies. Results. Increased total IgE levels were detectable in cryptococcosis patients (up to 43.875 µg/ml) with HIV+ patients showing a significant higher total IgE production compared with HIV- patients (pandlt;0.05). Conversely, total IgG4 levels did not differ among patients with different HIV status (pandgt;0.05), and neither IgG4 nor IgE levels differed between male and female patients (pandgt;0.05). Cn-specific IgG titers were higher in HIV- patients (pandlt;0.01) compared to HIV+ patients, but did not differ with the patients’ gender (pandgt;0.05). Preliminary immunoblot analysis of two sera from HIV+ patients revealed several immunoreactive cryptococcal antigens, including 130, 75, 40, 35 and 18 kDa proteins, which were determined to be IgG-immunoreactive. Conclusions. Compared to healthy people, who have estimated IgE levels andlt;0.72 µg/ml, patients with cryptococcal meningitis presented with markedly elevated IgE production. Specific cryptococcal antigens that were recognized by reactivity with IgG were for the first time detected using human serum samples. To identify infection-specific cryptococcal antigens that are involved in the pathogenesis of C. neoformans, further analyses including healthy Colombian control patients and HIV+ positive patients, not infected with C. neoformans or any other fungal agent, need to be done. Additional mass spectrometry analyses are also required to identify the immunoreactive cryptococcal proteins and their possible roles. The identification of proteins that are major targets of the humoral response of patients with cryptococcosis greatly extends the analysis of sera from mice with pulmonary cryptococcal infection done earlier by our group, which may contribute to vaccine development or adjunctive immunotherapy against C. neoformans infection.
Objetivo: La criptococosis es una micosis sistémica potencialmente mortal que afecta a seres humanos y animales. El grupo de trabajo de ISHAM sobre "Genotipado de Cryptococcus neoformans/C. gattii", que se utiliza globalmente para tipificar los agentes de la criptococosis, ha establecido un esquema MLST estandarizado. Este esquema incluye siete loci genéticos disociados, los genes CAP59, GPD1, LAC1, PLB1, SOD1, URA5, y la región IGS1. Los tipos de alelos y secuencias se registran en la base de datos MLST: http://mlst.mycologylab.org/. Presentamos un meta-análisis para discutir la epidemiología molecular mundial de los complejos de especies de C. neoformans/C. gattii basado en los datos actualmente publicados. Métodos: Al menos 47 documentos han presentado datos utilizando el esquema de consenso de ISHAM MLST y/o la base de datos de MLST hasta 2017. De ellos, sólo 23 incluyeron la lista de cepas, que representaban 1849 C. neoformans y 1141 C. gattii, cepas complejas de especies de 51 países. Resultados: La mayoría de las cepas analizadas por el MLST son VNI (51%) seguidas por VGII (25%), VGI (8%), VGIII (6%), VNIV (5%), VNII (3%), VNB y VNIV (1% cada una). Se identificaron un total de 465 tipos de secuencia (ST), 241 para el complejo de especies de C. neoformans y 224 para el complejo de especies de C. gattii. La diversidad de haplotipos (Hd) y nucleótidos (Pi) de los siete loci concatenados variaba según el tipo molecular principal y el continente de origen de las cepas. La población más diversa genéticamente se encontró entre las cepas de VNB en África. La VNIV en Europa, la VGII en América del Sur y la VGIII en América del Norte también mostraron una alta diversidad genética. El análisis del árbol de extensión mínima muestra que la población de VNI incluye dos grupos principales, uno que contiene predominantemente STs de Asia y el otro que contiene STs de Europa. Algunas TS son exclusivas de un continente específico y otras están presentes en todo el mundo, pero predominan en diferentes regiones, por ejemplo, en el caso de C. neoformans, las ST 4, 5, 6 y 31 son más frecuentes en Asia; las ST 1, 71, 77 y 93 predominan en Sudamérica; las ST 32 y 69 en África; y las ST 23, 59 y 63 en Europa. El VNB procede casi exclusivamente de África y el VNIV de Europa, pero también se informa ocasionalmente de ellos en otros continentes. Se observan patrones regionales similares entre los subtipos del complejo de especies de C. gattii, ST156 es exclusivo de Europa, ST6 de Norteamérica, pero las STs 51 y 7 se encuentran en varios continentes. La mayoría de las cepas complejas de C. neoformans (51%) tenían datos de factores de riesgo, con la presencia de factores de riesgo para adquirir criptococosis que variaban enormemente, del 100% (para todas las ST VNB) al 9% (para VNIV, ST324). Sólo el 7.7% de los casos de C. gattii tienen datos de factores de riesgo, y los números por TS son demasiado pequeños para hacer cualquier asociación. El análisis estadístico demuestra que las poblaciones con una mayor diversidad genética están asociadas con una mayor tasa de apareamiento de cepas de tipo a, lo que sugiere que la reproducción sexual es la principal vía de recombinación dentro de los complejos de especies de C. neoformans y C. gattii. Conclusión: Este trabajo destaca el significativo progreso que se ha hecho en todo el mundo hacia la tipificación de los aislados criptocócicos, que contribuyen a comprender la estructura de la población de estas levaduras de importancia médica.
