Culture-free genome-wide locus sequence typing (GLST) provides new perspectives on Trypanosoma cruzi dispersal and infection complexity
Artículo académico
Analysis of genetic polymorphism is a powerful tool for epidemiological surveillance and research. Powerful inference from pathogen genetic variation, however, is often restrained by limited access to representative target DNA, especially in the study of obligate parasitic species for which ex vivo culture is resource-intensive or bias-prone. Modern sequence capture methods enable pathogen genetic variation to be analyzed directly from host/vector material but are often too complex and expensive for resource-poor settings where infectious diseases prevail. This study proposes a simple, cost-effective 'genome-wide locus sequence typing' (GLST) tool based on massive parallel amplification of information hotspots throughout the target pathogen genome. The multiplexed polymerase chain reaction amplifies hundreds of different, user-defined genetic targets in a single reaction tube, and subsequent agarose gel-based clean-up and barcoding completes library preparation at under 4 USD per sample. Our study generates a flexible GLST primer panel design workflow for Trypanosoma cruzi, the parasitic agent of Chagas disease. We successfully apply our 203-target GLST panel to direct, culture-free metagenomic extracts from triatomine vectors containing a minimum of 3.69 pg/μl T. cruzi DNA and further elaborate on method performance by sequencing GLST libraries from T. cruzi reference clones representing discrete typing units (DTUs) TcI, TcIII, TcIV, TcV and TcVI. The 780 SNP sites we identify in the sample set repeatably distinguish parasites infecting sympatric vectors and detect correlations between genetic and geographic distances at regional (andlt; 150 km) as well as continental scales. The markers also clearly separate TcI, TcIII, TcIV and TcV + TcVI and appear to distinguish multiclonal infections within TcI. We discuss the advantages, limitations and prospects of our method across a spectrum of epidemiological research.
El análisis del polimorfismo genético es una poderosa herramienta de vigilancia e investigación epidemiológica. Sin embargo, el acceso limitado al ADN representativo de los patógenos suele restringir la inferencia de su variación genética, especialmente en el estudio de especies parasitarias obligadas para las que el cultivo ex vivo requiere muchos recursos o es propenso a los sesgos. Los métodos modernos de captura de secuencias permiten analizar la variación genética de los patógenos directamente a partir del material del huésped/vector, pero a menudo son demasiado complejos y costosos para los entornos con pocos recursos en los que prevalecen las enfermedades infecciosas. Este estudio propone una herramienta sencilla y rentable de "tipificación de secuencias de locus en todo el genoma" (GLST) basada en la amplificación paralela masiva de puntos calientes de información en todo el genoma del patógeno objetivo. La reacción en cadena de la polimerasa multiplexada amplifica cientos de objetivos genéticos diferentes, definidos por el usuario, en un único tubo de reacción, y la posterior limpieza en gel de agarosa y el código de barras completan la preparación de la biblioteca a menos de 4 dólares por muestra. Nuestro estudio genera un flujo de trabajo flexible de diseño de paneles de cebadores GLST para Trypanosoma cruzi, el agente parasitario de la enfermedad de Chagas. Aplicamos con éxito nuestro panel GLST de 203 objetivos a extractos metagenómicos directos y libres de cultivos de vectores triatómicos que contienen un mínimo de 3,69 pg/μl de ADN de T. cruzi y profundizamos en el rendimiento del método mediante la secuenciación de bibliotecas GLST de clones de referencia de T. cruzi que representan unidades de tipificación discreta (DTU) TcI, TcIII, TcIV, TcV y TcVI. Los 780 sitios SNP que identificamos en el conjunto de muestras distinguen repetidamente a los parásitos que infectan a vectores simpátricos y detectan correlaciones entre las distancias genéticas y geográficas a escala regional (andlt; 150 km), así como continental. Los marcadores también separan claramente TcI, TcIII, TcIV y TcV + TcVI y parecen distinguir infecciones multiclonales dentro de TcI. Discutimos las ventajas, limitaciones y perspectivas de nuestro método en un espectro de investigación epidemiológica.
